Приложение №3
Лабораторная диагностика ЗППП
1. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза
1.1. Биологические свойства хламидий
Хламидии (Chlamydia trachomatis) являются бактериями с характерной для прокариот структурой. Они представляют собой мелкие грамотрицательные микроорганизмы. Хламидии составляют группу облигатных внутриклеточных паразитов, так как не способны синтезировать АТФ и ГТФ, лишены ряда ферментных систем, следовательно не могут размножаться вне клетки хозяина. Наибольший тропизм хламидии проявляют к клеткам цилиндрического эпителия. Цикл развития хламидии включает две формы существования микроорганизма: элементарные тельца (ЭТ) - мелкие (0.15 - 02 мкм) неподвижные сферические организмы и ретикулярные (инициальные) тельца (РТ) - более крупные (около 1 мкм). ЭТ представляет собой высокоинфекционную форму возбудителя, адаптированную к внеклеточному существованию. ЭТ адсорбируется на
поверхность эпителиальной клетки при помощи специфического поверхностного термолабильного эффектора, структурно связанного с типоспецифическим хламидийным антигеном и комплементарного клеточному рецептору, содержащему сиаловую кислоту. Последняя разрушается нейраминидазой и ЭТ проникает в клетку. Хламидии не имеют активного механизма проникновения в чувствительную клетку. Проникновение ЭТ осуществляется посредством фагоцитарной активности клеток, при этом происходит ингибирование процесса слияния фагосомы, в которой они находятся, с лизосомами и тем самым “выключают” важнейший защитный клеточный механизм.В клетке начинается процесс деления ЭТ: в них увеличивается количество рибосом и полирибосом, визуализируется бактериальный нуклеоид, они увеличиваются в размере, появляются формы бинарного деления, формируется РТ, которое далее распадается на ЭТ. Из одного ЭТ образуется от 200 до 1000 новых “инфекционных единиц”, новых ЭТ. Обычно этот процесс длится 18-24 часа. Все это время возбудитель персистирует в фагосоме пораженной клетки. Вновь образовавшиеся ЭТ покидают клетку хозяина при ее разрушении, либо путем экзоцитоза, окруженные тонким ободком цитоплазмы. В последнем случае жизнеспособность клетки сохраняется. Предполагается, что данный механизм высвобождения ЭТ является одним из факторов бессимптомного и латентного течения хламидийной
инфекции.Вновь образовавшиеся ЭТ после выхода из пораженной клетки могут инфицировать новые здоровые клетки, что приводит к прогрессированию инфекционного процесса. Длительность инкубационного периода (от момента заражения до первых клинических проявлений) зависит от состояния организма, инфицирующей дозы, локуса поражения и может составлять в среднем от 14 до 35 дней.
В настоящее время различают по антигенной структуре 15 серотипов патогенных штаммов С. trachomatis. Так называемые “глазные” штаммы по эпидемическим особенностям и клиническим проявлениям хламидийной инфекции отличаются от “генитальных” штаммов. Первые (4 серовара С. trachomatis: А, В, Ва, С) вызывают классическую эндемическую трахому, передаются из глаз больного в глаза здорового контактным путем (обсемененные возбудителем руки, бытовые предметы и т.п.). Вторые (серовары от D до К) поражают различные отделы урогенитального тракта и, как правило, передаются половым путем. Возможно инфицирование глаз “генитальными” штаммами хламидий у взрослых и детей при заносе инфицированного материала руками, полотенцами и другими бытовыми предметами, при купании, особенно в бассейнах, а также у новорожденных во время родов при прохождении через родовые пути инфицированной матери.
С.trachomatis различных серотипов имеют общий групповой, родоспецифический антиген - липополисахаридный комплекс, в состав которого входит 2-кето-3-дезоксиоктановая кислота. Данная антигенная особенность позволяет определять хламидийный антиген группоспецифической сывороткой.
1.2. Подготовка больного к исследованию,
правила забора биоматериала
Качество взятия биоматериала для исследования, дальнейшая его обработка и хранение имеют важное значение для получения достоверных результатов.
При взятии биоматериала из урогенитального тракта для цитологического и иммунофлюоресцентного исследования необходимо соблюдать следующие правила.
1. Перед взятием материала из уретры рекомендуется задержка мочеиспускания 1.5 - 2 часа и более (предотвращение смыва пораженных клеток и возбудителя струей мочи); при наличии обильных гнойных выделений соскоб надо брать сразу, либо через 15-20 минут после мочеиспускания (лейкоциты и продукты их распада, большое количество белка и слизи затрудняют исследование и могут дать ложный результат). При отсутствии выделений следует провести массаж уретры с помощью одноразвого зонда для взятия материала. Перед взятием материала наружное отверстие уретры необходимо обработать тампоном, смоченным стерильным
физиологическим раствором.2. Соскоб следует брать специальным разовым зондом, на одном конце которого находится ватный тампон с повышенными сорбционными свойствами, либо синтетические ворсинки, обладающие такой же способностью (например: зонды АО “ЛАБдиагностика” - Россия, или “Medscand” - Щвеция
). В исключительных случаях соскоб можно брать ложкой Фолькмана соблюдая определенную осторожность во избежание повреждения слизистой оболочки уретры (примесь крови в биоматериале может исказить конечный результат исследования).3. В уретру мужчин зонд вводят на глубину 3-4 см (область ладьевидной ямки), в уретру женщин - на 1-1.5 (после предварительного ее массажа о лобковое сочленение) и делают несколько вращательных движений его кончиком. У детей зонд в уретру не вводят, материал берут с ее наружного отверстия. При взятии материала у женщин из цервикального канала предварительно удаляют слизистую пробку стерильным ватным тампоном и обрабатывают шейку матки стерильным физиологическим раствором. Зонд вводят в канал шейки матки на глубину 0.5-1.5 см. При наличии эрозий шейки матки их обрабатывают стерильным физиологическим раствором и материал берут зондом с границы здоровой и измененной ткани. Дальнейшие действия такие же, как при взятии материала из уретры. При извлечении зонда необходимо полностью исключить его касания стенок влагалища. После этого материал помещают на предметное стекло в виде мазка-отпечатка, многократно касаясь его поверхности кончиком зонда с
биоматериалом.4. В качестве материала для исследования используют также сок предстательной железы (после массажа простаты, предварительно обработав уретру стерильным физиологическим раствором) и осадок мочи после центрифугирования из которых готовят мазки.
При исследовании крови на наличие антител к хламидиям, забор ее следует проводить при выраженных общих клинических проявлениях (обострение простатита, аднексита, сальпингита, болезни Рейтера и т.п.) когда титр их повышается. Кровь берут из локтевой вены. Сыворотку крови для анализа получают обычным путем.
1.3. Лабораторная диагностика
Диагноз урогенитального хламидиоза основывается на данных анамнеза, клинической картине и подтверждается результатами лабораторных исследований. Результаты лабораторных исследований в процессе лечения позволяют оценить адекватность проводимой терапии, а по окончанию ее
оценить полноту излечения.Диагностическая значимость результатов лабораторных исследований зависит от следующих факторов:
1. Выбор соответствующего метода лабораторного исследования;
2. Правильная подготовка пациента к исследованию;
3. Правильное взятие врачом-клиницистом биоматериала для исследования из соответствующих очагов поражения;
4. Правильная предварительная подготовка биоматериала и своевременное проведение исследования;
5. Материально-техническое обеспечение лабораторного исследования;
6. Уровень квалификации медицинского персонала, проводящего исследование.
Для диагностики хламидийной инфекции в настоящее время используют четыре группы методов:
1. Культуральный метод;
2. Цитологический метод;
3. Методы, в основе которых лежат иммунологические реакции;
4. Методы, использующие принципы молекулярной биологии.
1.4. Культуральный метод
Культивирование С. trahomatis на перевиваемых линиях клеток млекопитающих, либо в клетках желточных мешочков куриных эмбрионов с последующей их идентификацией, является самым специфичным и наиболее чувствительным методом лабораторной диагностики хламидиоза. Культуральный метод считается “золотым стандартом”, с которым сравнивают специфичность и чувствительность всех других методов лабораторной диагностики. Для диагностики хламидиоза культуральным методом нужна специальная лаборатория, оборудованная всем необходимым для работы с культурами тканей и перевиваемыми линиями клеток, специально подготовленный высококвалифицированный медперсонал. Метод достаточно трудоемкий, требует значительного времени для получения окончательного ответа (от 3 до 14 дней и более при проведении нескольких пассажей). Поэтому до настоящего времени культуральный метод диагностики урогенитального хламидиоза не получил широкого распространения в практической лабораторной диагностике и используется в основном для научных целей, а также для сравнительной оценки специфичности и чувствительности других методов диагностики хламидиоза.
1.5. Цитологический метод
Цитологический метод лабораторной диагностики наиболее простой и доступный. Данный метод дает общее представление о цитологической картине, морфологии клеток из очага поражения, наличии микробного обсеменения, мицелия грибковой флоры и простейших. Специфические морфологические признаки позволяют определить наличие хламидий в препарате.
Материал от обследуемого берут после соответствующей подготовки специальным зондом со щеточкой или тампоном, обладающими повышенной сорбционной способностью.
На чистом обезжиренном предметном стекле готовят мазок-отпечаток путем многократного касания зондом его поверхности (с целью сохранения морфологической целостности клеточных элементов) и подсушивают его на воздухе.
Полученный препарат фиксируют метиловым спиртом (5 минут), либо абсолютным этиловым спиртом (5 минут), либо смесью Никифорова (1 часть этилового спирта и 2 части этилового спирта - 5 минут), либо охлажденным безводным ацетоном (3-5 минут).
После фиксации высушенные мазки окрашивают по Романовскому - Гимзе или по Маккиавело.
Окраска по Романовскому - Гимзе (можно проводить в ванночке или непосредственно красить мазок): краску Романовского - Гимзе разводят в соотношении 1:10 фосфатным буфером с рН 7.2 - 7.6 (1 часть краски и 9 частей фосфатного буфера) и наносят на мазок на 1-2 часа (время окраски подбирается опытным путем для вновь приготовленной партии краски), далее препарат промывают под проточной водой, прополаскивают дистиллированной водой, дифференцируют, погружая на 1-3 секунды в 96% этиловый спирт, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы при общем увеличении микроскопа в 900-1500 раз (ок. 10-15, об. 90-100).
При микроскопии элементарные тельца хламидий представляют собой мелкие (0.15-0.3 мкм) образования округлой формы, окрашенные в розовый или красноватый цвет. Они могут находиться как внеклеточно (преимущественно), так и внутриклеточно. Более крупные ретикулярные тельца (0.5-1.5 мкм) окрашиваются в различные оттенки от голубого до темно-синего цвета и находятся преимущественно внутриклеточно, при микроскопическом исследовании они обнаруживаются в виде скоплений вокруг ядра эпителиальной клетки в форме “шапочки жандарма” или диффузно.
Ядра клеток приданной окраски имеют вишневый оттенок различной интенсивности, а цитоплазма прокрашивается в нежно-голубой цвет.
Окраска по Маккиавелло: мазок-отпечаток на предметном стекле фиксируют над пламенем горелки несколько секунд и далее окрашивают 0.25% раствором основного фуксина в течение 5 минут. Затем краску смывают под проточной водой. Препарат помещают на несколько секунд в 0.5% раствор лимонной кислоты и затем промывают под проточной водой. Последний этап - дополнительное
окрашивание 1% раствором метиленового синего в течение 20-30 секунд, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы при общем увеличении микроскопа в 900-1500 раз.Ядра клеток окрашиваются в бледно-розовый цвет, цитоплазма - в нежно-голубой. Ретикулярные тельца (внутриклеточные) окрашиваются в различные оттенки голубого цвета (от светлого до темного), элементарные тельца имеют красноватый цвет и могут находиться как внутриклеточно, так и внеклеточно (преимущественно).
Цитологические методы просты в выполнении, дешевые, не требуют сложного оборудования, больших временных затрат, специальной подготовки и дополнительных навыков у лаборантов и врачей-лаборантов, владеющих техникой световой микроскопии. Однако их диагностическая значимость очень низкая: у больных мужчин диагностировать хламидийную инфекцию цитологическим методом в соскобах из уретры удается лишь в 10-15% случаев, а
у женщин - до 30-40% случаев (в соскобах из цервикального канала).В тоже время цитологический метод позволяет выявить неспецифические морфологические изменения эпителиальных клеток, которые могут косвенно свидетельствовать о наличии поражения урогенитального тракта, в том числе и хламидийной этиологии. Нормальные эпителиальные клетки имеют круглое ядро диаметром 10-15 мкм, цитоплазма при окраске по Романовскому-Гимзе прокрашивается в голубой цвет, хроматин - в пурпурный. Сама клетка - округлой формы, диаметр ее достигает 20-25 мкм. В соскобах у больных с хламидийной урогенитальной инфекцией могут быть следующие морфологические изменения эпителиальных клеток: клетки увеличены в размере, диаметром до 30 мкм и более, цитоплазма их нередко вакуолизирована, может иметь включения различного размера - от 0.3 до 0.5 мкм и более Иногда можно наблюдать клетки с явлениями фагоцитоза. В клетках происходит изменение морфологии ядра: отмечается полиморфизм, макронуклеоз - увеличение ядра до 15 мкм и более, полинуклеоз (2
и более ядер в клетке). В соскобах также могут встречаться лимфоциты, полиморфноядерные лейкоциты, плазмоциты и мононуклеарные клетки. Выраженность морфологических изменений часто коррелирует с выраженностью патологического процесса.Описанные клеточные изменения могут служить косвенным признаком хламидийной инфекции. Цитологический метод пригоден для проведения массовых и первичных обследований урологических и гинекологических больных с последующим обследованием их более специфическими и диагностически значимыми методами при получении патологических или сомнительных результатов.
1.6. Методы, в основе которых лежат иммунологические реакции
Данная группа методов основана на комплементарном взаимодействии специфического антигена (АГ) с антителом (АТ) с последующим проявлением продукта флюорохромом или посредством цветной биохимической реакции.
При диагностике урогенитального хламидиоза можно определять в биологическом материале либо наличие родоспецифического (группового) антигена (в моче, отделяемом половых органов, в материале из соскоба), либо специфические антихламидийные антитела - иммуноглобулины различных классов: А, М, G - в сыворотке крови. Для этого используют два основных метода: иммуноферментный анализ (ИФА) и реакцию иммунофлюоресценции (РИФ).
1.6.1
. ИФАИФА известен давно и широко применяется для диагностики в инфекционной патологии. В настоящее время на рынке диагностических тест-систем предлагается большое количество наборов как зарубежных, так и отечественных фирм-производителей. Методом ИФА преимущественно определяют наличие и титр (либо количество) противохламидийных антител - иммуноглобулинов различных классов в сыворотке крови обследуемого. Хламидии обладают слабой антигенной активностью, в следствие чего выработка и накопление антител в организме происходит в малых количествах. Кровь для исследования следует брать в период ярких клинических проявлений преимущественно системного характера. Сыворотку, полученную после центрифугирования, при необходимости можно хранить при температуре 4-8
° С до 5 дней, либо при температуре минус 20° С 1 месяц. Рекомендуется исследовать парные сыворотки для выявления динамики титра антител в процессе течения заболевания и проводимого лечения. Наборы ИФА-метода содержат в своем составе положительный и отрицательный контроли, по соотношению с которыми судят о наличии или отсутствии специфических антител и их количестве в сыворотке крови обследуемого. Методика постановки ИФА приводится в инструкции к каждому конкретному набору и включает как правило следующие основные этапы:1. Инкубация соответствующего разведения сыворотки крови обследуемого на планшете (или с шариком в пробирке) сенсибилизированным родоспецифическим хламидийным антигеном для взаимодействия с ним специфических противохламидийных антител (иммуноглобулинов) - образование комплекса антиген-антитело (АГ - АТ);
2. Отмывание планшета (шарика) от непровзаимодействовавших иммуноглобулинов;
3. Инкубация образовавшегося комплекса АГ-АТ с антисывороткой к иммуноглобулинам человека (общим или какого-либо определенного класса, в зависимости от того - определяется ли просто факт наличия АТ к хламидиям или наличие АТ, относящихся к определенному классу иммуноглобулинов А, М, G), меченой ферментом;
4. Отмывание планшета (шарика) от непровзаимодействовавших меченых антител;
5. Проведение ферментативной биохимической реакции в результате которой образуется цветной продукт. Интенсивность окраски раствора соответствует количеству фермента в реакционной смеси, следовательно количеству образовавшихся комплексов АГ-АТ, число которых определяется содержанием противохламидийных антител в сыворотке крови обследуемого. Количество окрашенного продукта промеряют на ридере (специальный фотоколориметр).
В последнее время появились ИФА тест-системы, в которых на 3 этапе используют антитела, меченые флюорохромами. В этом случае 5 этап не проводят, количество антихламидийных антител определяют измерением свечения образовавшихся сложных комплексов АГ-АТ-меченое АТ на ридере флюориметре.
Некоторые фирмы (Labsystems, Финляндия и др.) предлагают ИФА тест-системы для обнаружения хламидийного антигена в отделяемом, соскобах из урогенитального тракта и других локусов (конъюнктива, слизистая прямой кишки и пр.). Пациента готовят к обследованию по правилам, описанным выше. Биоматериал берут специальными зондами и помещают в транспортную среду для хранения и предварительной обработки. Дальнейшее проведение анализа имеет те же этапы, как при исследовании сыворотки крови. Обнаружить хламидийный антиген ИФА методом удается у 50-70% больных.
ИФА методы диагностики хламидийной инфекции получают все более широкое распространение в последнее время. Но необходимо отметить, что наличие противохламидийных антител в сыворотке крови свидетельствует о контакте организма с хламидиями. Обнаружить антихламидийные АТ удается, как правило, лишь у 55-65% больных, количество ложноположительных результатов может составлять 2-5%. Уровень антител зависит как от иммунореактивности организма, так и от скорости их элиминации из организма. Поэтому постановка диагноза хламидиоза по единичному анализу возможна лишь при наличии высокого титра противохламидийных антител преимущественно IgМ класса (показатель первичного иммунного ответа). Наиболее корректно использовать определение уровня противохламидийных АТ для оценки динамики течения заболевания и корректности проводимой терапии. Для этого проводят исследование парных сывороток крови. Четырехкратное и более увеличение титра АТ свидетельствует об обострении или прогрессировании заболевания. Снижение титра антител в процессе лечения свидетельствует об адекватности и эффективности проводимых лечебных мероприятий. Противохламидийные АТ могут сохраняться в организме после излечения до года и более.
ИФА методы сравнительно просты в выполнении, не требуют значительных временных затрат (время реакции от момента взятия материала до получения ответа составляет 1.5 - 3.5 часа). Однако для их выполнения необходим комплект оборудования для проведения ИФА (инкубатор, шейкер, вошер, ридер и набор автоматических микродозаторов), соответствующее помещение и подготовка медицинского персонала. Диагностическая значимость (специфичность и чувствительность) ИФА при урогенитальном хламидиозе составляет 50-70% по сравнению с культуральным методом.
1.6.2. РИФ
Реакция иммунофлюоресценции основана на взаимодействии противохламидийного АТ с родоспецифическим хламидийным антигеном. Существует два типа реакции иммунофлюоресценции - прямой и непрямой. В первом случае непосредственно специфическое антитело мечено флюорохромом и реакция проходит в один этап, что значительно сокращает сроки исследования. Во втором случае специфическое антитело не имеет метки, а для выявления комплекса АГ-АТ, образовавшегося на первом этапе, используют вторые меченые антитела, специфичные к антихламидийным антителам. Результат реакции оценивают визуально при помощи люминисцентного микроскопа.
Помимо импортных (например CHLAMYSET, Финляндия и пр.) появились отечественные наборы (например серия СЛАЙД: ХЛАМИслайд фирмы “ЛАБдиагностика”, Россия) для диагностики хламидийной инфекции реакцией прямой иммунофлюоресценции, которые практически не уступают им по специфичности и чувствительности, но имеют значительно более низкую цену.
Материалом для исследования служат мазки-отпечатки, приготовленные с соблюдением правил, приведенных выше. Мазки для РИФ готовятся на специальных деколированных стеклах в пределах ограниченной площадки диаметром 8-10 мм. После этого их высушивают на воздухе и фиксируют, погружая на 5-10 минут в холодный 96% (лучше абсолютный) этиловый спирт или нанося на препарат 0.1-0.1
5 мл охлажденного безводного ацетона до полного его испарения. Фиксированные препараты можно исследовать сразу или при необходимости хранить при комнатной температуре в течение суток или при минус 20° С в течение 2 недель (при этом необходимо исключить доступ влаги при хранении и доведении препарата до комнатной температуры перед исследованием при помощи полиэтиленового пакета и селикагеля).При проведении прямой РИФ на препарат наносят раствор меченых антител в количестве, необходимом для полного покрытия мазка (25-30 мкл). препарат инкубируют в горизонтальном положении во влажной камере в течение 15 минут при температуре 37
° С. Подсыхание реагента недопустимо во избежание ложноположительных результатов. Далее мазок промывают в проточной воде 30 сек, прополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и готовят к микроскопии.При проведении непрямой РИФ на препарат наносят необходимое количество раствора антихламидийных антител и проводят первую инкубацию в тех же условиях, что и при проведении прямой РИФ. Затем препарат промывают, высушивают на воздухе и наносят второй реагент - меченые антитела к хламидийным АТ и проводят вторую инкубацию так же во влажной камере при температуре 37
° С 15 минут. После промывания препарат высушивают и готовят к микроскопии. Готовые препараты рекомендуется просматривать сразу. При необходимости возможно хранение окрашенных препаратов в течение 1-2 суток при температуре 2-8° С в темном месте без доступа влаги.Микроскопию проводят с использованием иммерсионной системы. Возможны два варианта иммерсионной микроскопии:
1. Масляная иммерсия: На готовые высушенный препарат наносят 20-25 мкл монтирующей жидкости (глицерин, забуференный фосфатным буфером с рН 7.2-7.6), покрывают его обезжиренным покровным стеклом на которое затем наносят каплю нефлюоресцерующего иммерсионного масла и микроскопируют объективом (маркировка “Л” - люминисцентный) с увеличением 90 и окуляром с увеличением 5.
2. Водная иммерсия: на готовый препарат наносят каплю 20
мкл фосфатного буфера с рН 7.4 и микроскопируют объективом для водной иммерсии (маркировка - белая полоса и “Л” - люминисцентный) с увеличением 60 и окуляром с увеличением 5. Водная иммерсия дает более ровное, яркое и четкое свечение.Исследование готовых препаратов проводят люминисцентной микроскопией (микроскопы типа “Люмам Р-8”, “ЕС РПО-11”, ЛОМО, Россия).
В качестве люминисцентной метки обычно применяют ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианат), который при воздействии на него света с длиной волны 490 нм (синий), испускает свет с длиной волны 525 нм (зеленый). Для достижения этих условий в отечественных микроскопах используют следующий набор фильтров (в направлении от лампы): БС-8-3, СЗС-24-4, ФС-1-2 и светоделительную пластину “Зеленая -2”. Кроме того в наборах (в частности серия “СЛАЙД” АО “ЛАБдиагностика”, Россия) используются дополнительные флюоресцентные красители: бромистый этидий и синька Эванса, которые неспецифически прокрашивают структуры клеток и сопутствующую микрофлору, что значительно повышает информативность мазка, позволяет визуально оценить качество взятия биоматериала для исследования.
РИФ позволяет выявлять антигенные структуры как элементарных, так и ретикулярных телец. ЭТ расположены преимущественно внеклеточно, округлой формы с ровными краями, мелкие (размер 1:100 - 1:150 по отношению к окружающим их клеткам), однородной структуры, имеют яркое специфическое изумрудно-зеленое свечение, которое при работе микровинтом может давать дифракционные кольца (кольца Дилекторского). РТ встречаются значительно реже, располагаются преимущественно внутриклеточно, имеют менее однородную структуру, более полиморфны, но также с четкими краями и обладают ярким специфическим изумрудно-зеленым свечением. Любой другой флюоресцирующий материал неправильной формы, неровными нечеткими краями, имеющий неяркую зеленую
окраску, либо свечение другого цвета относится к артефактам. Интенсивность, яркость и оттенок специфического свечения зависит от рН монтирующей жидкости или буфера используемого для микроскопии. Большая интенсивность свечения ФИТЦ в щелочной среде увеличивает чувствительность метода, но ведет к увеличению числа объектов с неспецифическим свечением, а следовательно к ложноположительным результатам. В кислой среде интенсивность свечения ФИТЦ падает, что может дать ложноотрицательный результат. Сопутствующая микрофлора, а также ядра окружающих клеток неспецифически окрашиваются в различные оттенки оранжевого цвета бромистым индием, их цитоплазма - в различные оттенки кирпично-коричневого цвета синькой Эванса.Для получения достоверного результата рекомендуется просматривать многие поля зрения препарата. Результат считается положительным в том случае, если препарат содержит клетки эпителия и удается обнаружить не менее 6 элементарных телец, имеющих все вышеперечисленные признаки.
Обнаружение меньшего количества возбудителя делает результат сомнительным и требует повторного исследования, желательно на фоне провокации (пищевая - алкоголь, медикаментозная - инъекция пирогенала, механическая - массаж уретры на буже). Контроль излеченности следует проводить не ранее чем через две недели, так как возможно сохранение не элиминированного антигенного материала нежизнеспособного возбудителя, что будет давать ложноположительные результаты. Получение 3 отрицательных результатов исследования у мужчин в течение месяца и у женщин в течение 3 менструальных циклов, отсутствие клинических проявлений хламидийной инфекции свидетельствует о выздоровлении.
РИФ при правильной подготовке пациента, соблюдении правил взятия материала и постановки реакции является высокочувствительным и специфичным методом диагностики урогенитального хламидиоза и позволяет выявлять возбудителя у 90-95% больных. Данный метод относительно дешев, прост в выполнении, высокоинформативен, не требует специального дорогостоящего оборудования, позволяет быстро получить результат (0.5 - 1 час) и визуально контролировать качество взятия материала для исследования.
1.6.3. Методы, использующие принципы молекулярной биологии
В группу входят методы ДНК-зондов и полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые позволяют выявить генетический материал возбудителя (уникальные высоко специфические участки ДНК) в исследуемом биоматериале. Наборы для диагностики хламидиоза ДНК-зондами находятся пока на стадии разработки и клинических испытаний.
ПЦР открыта в 1983 году и в последнее время активно внедряется в практику лабораторной диагностики. Метод основан на выделении специфической последовательности ДНК или РНК возбудителя при помощи комплементарных праймеров (искусственно синтезированных олигонуклеидов), последующего ее многократного копирования (амплификации) и накопления для дальнейшего выявления обычными методами детекции (электрофорез или ИФА). Данный метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, практически приближающейся к культуральному и позволяет обнаружить единичных возбудителей в исследуемом материале. Метод ПЦР требует специального дорогостоящего оборудования, отдельной специально оснащенной лаборатории, соответствующей подготовки и высокой квалификации медицинского персонала. Вместе с тем, отсутствие сертификации
используе-мых в России праймеров и достаточного опыта применения метода ПЦР, специфичность исследуемого материала, частая его контаминация сопутствующей микрофлорой (что может давать ложноположительные результаты) не позволяет однозначно судить о его ценности при диагностике урогенитального хламидиоза.Таким образом, в настоящее время наиболее доступным, простым и в то же время высокоинформативным методом диагностики урогенитального хламидиоза и установления излеченности является реакция прямой иммунофлюоресценции (РИФ). Контроль за динамикой течения заболевания и эффективностью лечения следует проводить, определяя титр антихламидийных антител в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА).
2. Лабораторная диагностика урогенитального микоплазмоза
Микоплазмы относятся к семейству Mycoplasmataceae, входящему в порядок Mycoplasmatales класса Milicutes. Это семейство разделяется на 2 рода: род Mycoplasma, включающий около 100 видов, и род Ureaplasma, в котором насчитывается пока только 3 вида. Микоплазмы широко распространены в природе, они обнаружены у млекопитающих, птиц, рыб, маллюсков, насекомых, растений. Установлено что, человек является естественным хозяином по крайней мере 14 видов микоплазм. Однако клинически доказана патогенность для человека
лишь 4 видов: Mycoplasma pneumoniae, M. hominis, Ureaplasma urealyticum.M. pneumoniae является возбудителем респираторных заболеваний, к числу которых относится прежде всего первичная атипичная пневмония, чаще протекающая как комбинированная микоплазменно-вирусная инфекция. Она нередко переходит в хроническую форму с развитием аутоиммунных осложнений. Описаны также случаи менингитов, поражения черепно-мозговых нервов, периферических отделов ЦНС, почек, печени, эндокарда, вызываемых М. pneumoniae.
М. genitalium первоначально выделена из урогенитального тракта. Однако, подобно М. pneumoniae, обладает выраженным пневмотропным действием и весьма близка ей по генетическим и антигенным признакам. Вопрос о патогенной роли М. genitalium в поражении урогенитального
тракта окончательно не прояснен.М. hominis колонизирует урогенитальный тракт взрослых, детей и даже новорожденных, которые вероятно инфицируются при прохождении родовых путей. У новорожденных колонизирует чаще всего носоглотку и влагалище. У мальчиков инфекция выявляется реже, чем у девочек. В течение первого года жизни число детей инфицированных микоплазмой постепенно уменьшается. После достижения половой зрелости и увеличения частоты половых контактов инфицированность микоплазмами резко возрастает. Наибольшая обсемененность М. hominis отмечена среди лиц 30-40 лет и коррелирует с частотой половых контактов. У мужчин М. hominis колонизирует уретру и крайнюю плоть, у женщин влагалище, реже шейку матки и уретру.
Ureaplasma urealyticum обладает наибольшим патогенным потенциалом для урогенитального тракта человека по сравнению с другими микоплазмами. Уреаплазмы чаще персистируют на слизистой уретры, цервикального канала. Более часто уреаплазмы выявляются у лиц с повышенной сексуальной активностью, при воспалительных заболеваниях гениталий, при беременности.
Микоплазмозы (уреаплазмоз) широко распространены среди населения. Они передаются при половых контактах и их часто относят к заболеваниям передаваемым половым путем. Однако микоплазмоносительство не всегда является показателем патологического процесса, развитие которого зависит от множественности инфекции, локализации, распространенности и свойств возбудителя, а также от состояния макроорганизма: Особенности иммунной системы, гормонального статуса и физиологического состояния человека. Но при определенных условиях: сопутствующие инфекции, снижение иммуннорезистентности организма, изменение и нарушение гормонального фона, носительство может привести к развитию клинически выраженной инфекции и вызвать серьезные последствия. Прежде всего - воспалительные заболевания различных отделов урогенитального тракта, бесплодие, прерывание беременности, преждевременные роды, внутриутробное инфицирование плода, возможное тератогенное действие.
Распространенность микоплазмозов и неадекватность проводимой лекарственной терапии привели к преобладанию этих инфекций над “классическими” венерическими заболеваниями. Это требует выработки лабораторных критериев, позволяющих проводить этиологическую диагностику и оценивать эффективность проводимых лечебных мероприятий.
2.1. Биологические свойства микоплазм
Микоплазмы являются самыми мелкими свободно живущими прокариотами. Средние размеры клеток составляют 0.27-0.74 мкм, средний диаметр 0.42 мкм.
Отличительными особенностями микоплазм и уреаплазм, уникальными для прокариот являются:
- отсутствие клеточной стенки и ее предшественников, что обуславливает такие свойства как пластичность, полиморфизм, высокая осмотическая чувствительность, полная резистентность к различным химическим агентам, подавляющим синтез компонентов клеточной стенки;
- минимальное количество органелл;
- наименьший размер генома среди прокариот (500-1000 МД, составляющий 1/16 генома Е. Coli;
- низкое соотношение Г+Ц пар в ДНК;
- способность паразитировать (персистировать) на мембране клеток эукариот.
У человека микоплазмы могут поражать различные клетки, в том числе сперматозоиды, нарушая их подвижность и способность процесса пенетрации в ходе взаимодействия сперматозоидов и яйцеклетки.
Механизмы связывания микоплазм и клеток окончательно не изучены. Предполагается, что они взаимодействуют с некоторыми рецепторами белковой природы и благодаря своей протеолитической и фосфолипазной активности проникают в инфицированную клетку. Микоплазмы обладают эндо- и экзонуклеазной активностью, способны влиять на нуклеиновый обмен инфицированных ими клеток, что может вызвать серьезные изменения метаболизма и привнести в клетку новую генетическую информацию.
Размножение микоплазм осуществляется равновеликим и неравновеликим делением материнской клетки, почкованием, фрагментацией нитей, а также путем образования в цитоплазме клетки или на ограничивающей мембране так называемых элементарных тел, размером 0.100-0.250 мкм.
Отличительной особенностью Ureaplasma urealyticum от других микоплазм является их способность гидролизировать мочевину до аммиака в следствие наличия у них уреазной активности.
2.2. Биологический материал, исследуемый при микоплазмозах
При подозрении на микоплазмоз, для исследований берут пробы со слизистой уретры, сводов влагалища, из канала шейки матки, периуретральной области и крайней плоти. Мочу для выявления микоплазм предпочтительно брать из утренней первой и средней порции и исследовать ее центрифугат. При простатитах исследуют секрет предстательной железы. Сперму исследуют при мужском бесплодии неясной этиологии. Возможно также исследовать материал полученный при лапароскопии, амниоцентезе, а также тканей абортированных и мертворожденных плодов.
2.3. Подготовка больного к исследованию,
правила забора биоматериала
Широкое распространение бессимптомного микоплазмоносительства часто затрудняет постановку истинного этиологического диагноза. Поэтому предварительно необходимо тщательно собрать анамнестические данные и исключить иную этиологическую причину поражения урогенитального тракта.
При подготовке больного к лабораторному исследованию соблюдаются те же правила, что и при исследовании на хламидиоз.
2.4. Лабораторная диагностика
Как и при диагностике хламидийной инфекции, при диагностике микоплазмозов используют в настоящее время четыре группы методов:
1. Культуральные методы;
2. Цитологический метод;
3. Методы, в основе которых лежат иммунологические реакции;
4. Методы, использующие принципы молекулярной биологии.
2.4.1. Цитологический метод
Цитологический метод имеет относительное диагностическое значение. Он не позволяет непосредственно поставить этиологический диагноз, однако дает представление о качестве взятия материала (если выполняется параллельно с взятием материала для исследования другими методами особенно культуральным и ПЦР), цитологической картине в очаге поражения, наличии сопутствующей микрофлоры.
Взятие материала, подготовку его к исследованию, фиксацию и окраску мазков проводят так же, как при исследовании на хламидиоз.
2.4.2.Культуральный метод
Наиболее специфичным методом является культуральный. В отличии от хламидий, микоплазмы способны размножаться на бесклеточных питательных средах. Рост микоплазм зависит от состава культуральной среды, так как они имеют ограниченные метаболические возможности. Ростовые среды для культивирования микоплазм имеют сложный состав и содержат как природные, так и синтетические компоненты. Наиболее широко применяют следующие питательные cреды: SP - 4 - предназначена для культивирования М. genitaleum, M. pneumoniae. Фирма BioMeri
eux (Франция) поставляет готовый набор питательных сред для выделения M. hominis, и U. urealyticum (“Mycoplasma-Lyo” набор); R1 - Среда предназначена для первичных посевов клинических образцов, а также в качестве транспортной среды, что весьма существенно для сохранения жизнеспособности микоплазм в случаях, когда посев на питательный агар непосредственно после взятия образцов затруднен; R3 - позволяет оценивать количество жизнеспособных клеток М. hominis и U. urealyticum в исследуемых образцах.Большинство микоплазм - факультативные анаэробы, поэтому рост их лучше при применении газовой смеси 5% СО2+ 95% N2. Посевы на питательных средах инкубируют при 37
° С в течение 7-14 дней. U. urealyticum более чувствительна к изменению рН среды, поэтому пересев уреаплазм из жидкой среды с мочевиной следует делать сразу после незначительного изменения ее цвета (изменение цвета индикатора, входящего в состав инкубационной среды в результате ее защелачивания аммиаком, образующимся при гидролизе уреазой мочевины). Рост при пересеве появляется в те же сроки, что и при первичном посеве (изменение цвета индикатора входящего в состав среды). Обычно рост культур U. urealyticum появляется через 1-3 суток, М. pneumoniae, M. genitaleum и M. hominis через 3-5 суток. Посевы на плотных средах просматривают при малом увеличении микроскопа (60-100 раз) на 3-5 сутки инкубации и позже. M. hominis и M. genitaleum образуют, как правило относительно более крупные колонии (0.1- 0.3 мм), чем U. urealyticum (0.01-0.03 мм). Выделенные культуры идентифицируют, используя различные модификации иммунологических методов: реакцию ингибиции роста (РИР), реакцию ингибиции метаболизма (РИМ), реакцию иммунофлюоресценции (РИФ) и ее макровариант в чашке Петри - эпииммунофлюоресценцию.Классический бактериологический метод является наиболее специфичным, однако он имеет следующие недостатки: продолжительность, сравнительно высокая стоимость питательных сред, возможность получения достоверного результата только при наличии в биологическом материале жизнеспособных возбудителей.
2.4.3. Методы, в основе которых лежат
иммунологические реакции
Широкое распространение микоплазмоносительства часто приводит к выделению возбудителя от клинически здоровых людей, либо от больных, у которых микоплазмы являются сопуствующей микрофлорой. Поэтому культуральные методы должны сочетаться с иммунологическими, выявляющими как антиген возбудителя и его количество, так и выраженность реакции организма на его присутствие - антитела и их титр.
Для обнаружения АГ (антигена) микоплазм используют метод РИФ (реакция иммунофлюоресценции) - прямая и непрямая ее модификация.
В настоящее время появились тест-системы для обнаружения АГ M. hominis и U.urealyticum методом прямой иммунофлюоресценции в отделяемом из урогенитального тракта отечественного производства (например - “МикоСлайд” и “УреаСлайд” производства АО “ЛАБдиагностика” и др.).
Принцип РИФ, основные этапы ее постановки и оценка полученных результатов такие же, как при исследовании на хламидиоз (см. выше).
Материалом для исследования служат мазки-отпечатки, которые берут и готовят по тем же правилам, что и при исследовании на хламидиоз. Кроме мазков, можно проводить исследование спермы и сока предстательной железы, из которых также готовятся препараты на предметном стекле. Из-за отсутствия клеточной стенки микоплазмы обладают высокой осмотической чувствительностью. Поэтому следует обратить особое внимание на быструю фиксацию биоматериала, сразу после его подсыхания на стекле. Фиксировать материал необходимо холодным (2-8
° С) безводным ацетоном, нанося его на препарат (0.1-0.15 мл) до полного испарения. Мазки следует сразу “красить” (ставить РИФ). Хранение фиксированных мазков не желательно и допускается в исключительных случаях при температуре минус 20° С без доступа влаги не более 2-3 суток.После проведения реакции, промывки и высушивания препараты микроскопируют с использованием люминисцентного микроскопа. Так как в качестве флюоресцентной метки для специфических противомикоплазменных и противоуреаплазменных АТ также используется ФИТЦ (флюоресцеин-изотиоцианат), то подготовка препарата к микроскопии, набор фильтров микроскопа для возбуждения свечения ФИТЦ, объективы и окуляры такие же, как и при исследовании препаратов на хламидиоз.
При микроскопии микоплазмы и уреаплазмы выявляются в виде полиморфных структур: зерна, гранулы, кокко-палочки. Они могут располагаться на поверхности эпителиальных клеток, лейкоцитов, в образцах спермы - на поверхности сперматозоидов, а также во внеклеточном пространстве. Основные специфические признаки - яркое зеленое свечение, однородная структура, четкие ровные края. Неспецифическая микрофлора окрашивается в оранжевый цвет, ядра клеток эпителия, лейкоцитов, сперматозоиды - в оранжевый цвет, цитоплазма клеток - в красно-бурый цвет.
Результат считается положительным при наличии не менее 10-15 объектов, имеющих яркозеленое свечение, соответствующее расположение и другие специфические признаки. При отрицательном результате в мазке отсутствует специфическое свечение при обязательном наличии не менее 10 клеточных элементов.
Для диагностики микоплазмозов методом РИФ необходим определенный опыт и навыки люминисцентной микроскопии, правильная подготовка больного к исследованию, соблюдение всех правил взятия материала, его обработки и постановки РИФ. Все это позволит снизить количество артефактов, а следовательно количество ложноположительных результатов.
Метод РИФ позволяет выявлять микоплазмы непосредственно в материале (мазках) от больных, требует минимальных затрат времени (возможность получить ответ в течение часа), не требует дорогостоящего оборудования и специальной лаборатории. Стоимость тест-систем для РИФ значительно ниже стоимости культуральных сред.
Данный метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, сопоставимой с культуральной диагностикой. Применим для диагностики микоплазмозов практически в любом клиническом материале. Существенным достоинством метода является возможность визуальной оценки: качества взятия материала для исследования, а следовательно и идентификация артефактов, и количества возбудителя в исследуемом материале, что может служить косвенным показателем выраженности инфекционного процесса.
Для подтверждения диагноза урогенитального микоплазмоза при выделении возбудителя из клинического материала, оценки тяжести заболевания и эффективности проводимой терапии, необходимо проводить исследования на наличие антител к микоплазмам и определение их титра. В связи с тем, что среди здоровых лиц, широко распространена инаппарантная микоплазменная инфекция, сопровождаемая наличием в сыворотке специфических антител, диагностическое значение может иметь только нарастание титра антител в течение болезни в 4 раза и более. Для этого проводят исследования парных сывороток. Ранее для выявления специфических тел к микоплазмам использовали методы РСК (реакция
связывания комплемента) и РНГА (реакция непрямой гемаглютинации). В настоящее время для выявления специфических антител к микоплазмам применяют метод ИФА (иммуноферментный анализ). Принцип метода и основные этапы его постановки описаны выше. Исследуют парные сыворотки, взятые в различные периоды заболевания. До исследования сыворотки хранят, как описано выше. Нарастание титра специфических антител свидетельствует о прогрессировании инфекционного заболевания. Снижение титра специфических антител в процессе лечения свидетельствует об адекватности выбранной терапии.Метод ИФА позволяет одновременно исследовать большое количество клинических образцов. Однако для его проведения необходим набор стандартного оборудования для ИФА. Время для проведения анализа составляет от 3 до 6 часов. Для постановки ИФА необходима специально оборудованная лаборатория и соответствующая подготовка медицинского персонала.
2.4.4. Методы, использующие принципы молекулярной биологии
Данные методы основаны на идентификации в клинических образцах нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), специфичных для данного микроорганизма. В группу входят два основных метода: гибридизация на основе ДНК-зондов и диагностика на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Проведение ДНК-ДНК гибридизации с образцами
клинических проб и ДНК-зондами заданной специфичности позволяет успешно идентифицировать основные виды микоплазм в количестве 10000-100000 клеток/пробу. При работе оптимально подобранными зондами перекрестные реакции практически отсутствуют. ДНК-зонды метятся либо радиоактивными фосфором, либо лигандом, для распознавания которого используют специфические антитела, конъюгированные с ферментом (пероксидазой или щелочной фосфатазой). Диагностика должна проводиться персоналом имеющим навыки молекулярно-биологической работы.Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) основан на избирательной амплификации in vitro фрагмента ДНК исследуемого микроорганизма с последующей его идентификацией. По чувствительности ПЦР превосходит все известные на сегодня методы диагностики и позволяет достоверно выявлять единичные клетки возбудителя. Проведение ПЦР-диагностики возможно в специально оборудованной лаборатории при соблюдении жестких технологических правил. Работа осуществляется персоналом, прошедшим подготовку в области молекулярной диагностики.
Наборы для ПЦР-диагностики микоплазмозов производятся рядом отечественных фирм: “Биомастер”, “Нобитех”, НИИ физико-химической медицины (Москва).
Высокая чувствительность данных методов при широком распространении бессимптомного микоплазмоносительства не позволяют однозначно судить об их диагностической значимости и ценности. Обнаружение возбудителя в биологическом материале требует проведения исследований, подтверждающих его этиологическую роль. Прежде всего, это определение динамики титра специфических антител.
Таким образом, диагноз урогенитального микоплазмоза основывается на анамнестических, эпидемиологических данных, клинической картине заболевания и результатах лабораторных исследований. При проведении лабораторных исследований определяют наличие возбудителя в материале от больного одним из вышеописанных методов. При этом, в настоящее время предпочтительнее метод РИФ, как наиболее простой в выполнении, не требующий значительных материальных и временных затрат, специально оборудованной лаборатории и специальной подготовки медицинского персонала. Для выявления этиологической роли в развитии заболевания, тяжести инфекционного процесса, эффективности проводимого лечения необходимо определять динамику титра антител в парных сыворотках методом ИФА.
3. Лабораторная диагностика урогенитального трихомониаза
Трихомонады являются жгутиковыми эукариотами и относятся к простейшим из класса Flagellata (жгутиконосцы), семейства Trichomonadida, рода Trichomonas. В человеческом организме паразитируют 3 вида трихомонад: Trichomonas intestinalis - кишечная трихомонада, Trichomonas elongata (tenax, buccalis) - ротовая трихомонада и Trichomonas vaginalis - влагалищная трихомонада. Только Tr. vaginalis поражает урогенитальный тракт и является патогенной для
человека, вызывая различные воспалительные заболевания: уретрит, простатит, эндоцервицит, вагинит, бартолинит и т.д.3.1. Биологические свойства Tr. vaginalis
Влагалищные трихомонады являются одноклеточными простейшими. Форма их вариабельна, чаще грушевидная - в нативных препаратах (висячая капля), но наряду с этим могут наблюдаться овальные, шарообразные, несколько удлиненные - веретенообразной формы. Длина тела влагалищной трихомонады колеблется от 5 до 30 мкм (в среднем - 13 мкм), ширина тела - 5-8 мкм.
Она покрыта оболочкой - пелликулой. Тело влагалищной трихомонады состоит из цитоплазмы, ядра, парабазального тела, блефаропласта, ризопласта, аксостиля, ундулирующей мембраны, краевой и парабазальной фибриллы и жгутиков. Цитоплазма состоит из тонкозернистой массы. Ядро продолговато - овальной формы, расположено в передней трети тела. Впереди ядра, на переднем конце тела трихомонады, находится блефоропласт, от которого берут начало направляющиеся вперед 4 свободных жгутика. Они выполняют роль органоидов движения и принимают участие в захватывании пищи. Обнаружение жгутиков при просмотре нативных препаратов служит существенным дифференциально-диагностическим признаком влагалищных трихомонад от других элементов просматриваемого материала (лейкоциты, эпителиальные клетки). Степень подвижности жгутиков отражает биологическую активность (полноценность) возбудителя. В окрашенных препаратах жгутики часто трудно различимы, что обусловлено их хрупкостью и повреждением при фиксации и окраске препарата.Влагалищные трихомонады размножаются бесполым путем - деления. Наряду с простым продольным делением на две части, возможно множественное деление. Полный цикл деления занимает у разных особей от 0.5 до 1.5 - 3 часов. Перед делением движение трихомонады замедляется, разделяется блефаробласт и жгутики, число которых удваивается. Далее делится ядро, дочерние ядра расходятся к противоположным полюсам. После перешнуровки цитоплазмы образуются две новые особи.
Трихомонады являются факультативными анаэробами. Оптимум роста наблюдается при 37
° С. Они легко культивируются в питательных средах в присутствии или отсутствии других микроорганизмов.Встречаются штаммы влагалищных трихомонад, которые авирулентны для их носителей и не вызывают у них видимых клинических реакций со стороны слизистых мочеполовых органов. Однако, при передаче их в процессе полового акта партнеру с переменой условий обитания они становятся патогенными и вызывают развитие воспалительного процесса в слизистой мочеполовых органов. Возможен переход асимптомной формы трихомониаза в манифестную при нарушении равновесия между макроорганизмом и влагалищной трихомонадой (переход авирулентной формы в вирулентную) вследствие изменения реактивности организма, происходящим при инфекционных заболеваниях, переохлаждении, переутомлении, изменении гормонального статуса, при действии нервно-психических травм и других стрессорных факторов, приводящих к снижению как местной, так и общей иммуннорезистентности.
Инвазия влагалищной трихомонады способствует переходу постоянных сапрофитов уретры и влагалища у здоровых лиц в вирулентное состояние, что ведет к усилению токсигенного воздействия на ткани органов урогенитального тракта. В результате этого развивается смешанный трихомонадно-бактериальный воспалительный процесс, в котором первичным этиологическим агентом является Tr. vaginalis.
Вагинальные трихомонады способны фагоцитировать бактерии и другие частицы, которые затем, как правило, перевариваются. Однако возможна персистенция бактерий (в частности гонококков) внутри трихомонады, что способствует их длительному существованию в организме в скрытом, недоступном для антибактериальной терапии состоянии.
Влагалищные трихомонады могут сохранять жизнеспособность в неразведенных выделениях или в культурах, разведенных физиологическим раствором, или в других солевых растворах в течение нескольких часов, однако они плохо переносят гипотонические растворы, а высушивание и температура свыше 45
° С убивает их мгновенно.3.2. Подготовка больного к исследованию,
правила забора биоматериала
Диагноз мочеполового трихомониаза устанавливается только при обнаружении влагалищной трихомонады при лабораторном исследовании. С целью повышения эффективности диагностики необходимо проводить повторные многократные лабораторные обследования.
Материалом для исследований служит отделяемое из уретры, цервикального канала, влагалища, секрет предстательной железы, содержимое парауретральных ходов, бартолиниевых желез, а также из других возможных очагов заболевания (со слизистой оболочки зева и прямой кишки). Материал для исследования у женщин следует брать перед менструацией или через 1-2 дня после ее окончания, так как в этот период количество влагалищных трихомонад увеличивается, а клиника мочеполового трихомониаза усиливается.
Перед исследованием пациент не должен мочиться в течение 3-4 часов. Женщины, кроме того, в день явки на обследование не должны спринцеваться и проводить туалет половых путей. Перед обследованием следует воздерживаться от половых сношений. За 5-7 дней до обследования необходимо прекратить прием медикаментов и лечебные процедуры, проводимые при лечении урогенитальных заболеваний, так как они могут воздействовать на влагалищные трихомонады деформируя и обездвиживая их.
При наличии обильных выделений проводят туалет уретры, удаляя стекающую каплю из ее наружного отверстия ватным тампоном смоченным стерильным теплым физиологическим раствором. Брать для исследования на трихомонады свободно стекающую каплю уретральных выделений нецелесообразно, так как влагалищные трихомонады в ней деформированы и неподвижны
.У мужчин в уретру вводится стерильный зонд (стерильные бактериологические петля, желобоватый зонд, ушная ложечка и т.п.) на 4-5 см и осторожно, легким поскабливанием со слизистой уретры берется ее отделяемое для лабораторного исследования. При взятии соскобов необходимо избегать травматизации слизистой, так как примесь крови к уретральным выделениям снижает качество лабораторного исследования.
Секрет предстательной железы, семенных пузырьков и куперовых желез исследуются по миновании острых явлений простатита, везикулита.
У женщин при отсутствии явлений острого уретрита и обильных выделений, перед взятием материала из уретры проводят ее массаж в течение 0.5-1 минуты о лобковое сочленение. Со лизистой уретры делают соскоб стерильным зондом или другим подобным инструментом. Для исследования берут также соскоб или смыв (2-3 мл теплого физиологического раствора) с заднего свода влагалища. Перед взятием материала из канала шейки матки, влагалищная ее часть обтирается стерильным тампоном, смоченным физиологическим раствором, убирается слизистая пробка. Стерильный зонд вводят в цервикальный канал, осторожно, избегая травматизации слизистой на глубину не более 1-1.5 см.
При хроническом и вялотекущем мочеполовом трихомониазе лабораторные исследования целесообразно проводить после провокации, что значительно повышает вероятность обнаружения возбудителя. Рекомендуется применять один из следующих методов провокации:
1. Биологическая - однократное внутримышечное введение гоновакцины взрослым в количестве 500 млн микробных тел, детям старше 3-х лет 100-200 млн микробных тел. Детям до 3 лет гоновакцину не вводят;
2. Термическая - женщинам проводят диатермию с абдоминально-вагинально-сакральным расположением электродов в течении 3-х дней по 30, 40, 50 минут или индуктотермию в течение 3-х дней по 10, 15, 20 минут. Через один час после каждого прогревания производят забор отделяемого из уретры, цервикального канала и прямой кишки;
3. Механическая - мужчинам проводят массаж уретры на буже в течении 10 минут после чего производят забор материала, а женщинам накладывают металлический колпачок на шейку матки на 4 часа, после чего исследуют его содержимое;
4. Алиментарная - употребление соленой, острой пищи, а также алкоголя за 24 часа до лабораторных исследований.
Не следует проводить химические провокации: инстилляция в уретру и смазывание цервикального канала растворами азотно-кислого серебра, так как они губительно действуют на влагалищную трихомонаду.
Провокации не проводят женщинам во время менструации. Забор материала для исследования производят как после провокации, так и через 24-48-72 часа. Повторные исследования повышают вероятность обнаружения влагалищных трихомонад.
Материал для исследования берут специальными одноразовыми зондами, либо стерильной ложкой Фолькмана или ушным зондом с затупленным концом.
Следует также применять метод обогащения материала, для чего у женщин получают смыв отделяемого влагалища теплым физиологическим раствором или раствором Рингера-Локка в объем 10 мл, у мужчин с той же целью в уретру вводят 5-7 мл аналогичных растворов. Полученный смыв центрифугируют в течении 30 минут при 1500 об/мин, осадок служит материалом для лабораторного исследования.
3.3. Лабораторная диагностика
В настоящее время для обнаружения Tr. vaginalis используют следующие основные методы:
1. Микроскопия нативных препаратов;
2. Микроскопия окрашенных препаратов;
3. Культуральный метод;
4. Иммунологический метод.
3.3.1. Микроскопия нативных препаратов
При микроскопии нативных препаратов, возбудителя обнаруживают по его специфическому движению среди клеточных элементов и микроорганизмов в препарате, приготовленном непосредственно перед исследованием. Просмотр влагалищной трихомонады в нативных препаратах проводят чаще методом раздавленной капли - “капли-суспензии” и реже методом “висячей” капли.
При приготовлении препарата “капли-суспензии” на сухое, обезжиренное и предварительно прогретое до 37
° С предметное стекло наносят каплю теплого физиологического раствора хлорида натрия и смешивают в нем исследуемое отделяемое из очага заболевания (теплый физиологический раствор активирует влагалищную трихомонаду и увеличивает ее подвижность). Взвесь накрывают покровным стеклом, избегая образования воздушных пузырьков в препарате. Избыток жидкости, вышедшей за границы покровного стекла удаляют фильтровальной бумагой. Смывы со слизистой уретры, влагалища и негустые осадки центрифугатов, полученных на физиологическом растворе, а также культуры трихомонад, выделенные на жидких средах исследуются в нативных препаратах без дополнительного разведения.При приготовлении препарата “висячая капля” точно на середину покровного стекла, края которого предварительно смазываются вазелином, наносится теплый (37-38
° С) физиологический раствор к которому добавляется исследуемый материал и осторожно перемешивается. Вазелин замыкает со всех сторон препарат и предохраняет его от растекания. Покровное стекло осторожно переворачивают и накладывают каплей вниз над лункой специального предметного стекла для просмотра “висячей капли”. Капля должна свободно свисать в углублении предметного стекла не соприкасаясь с его краями и дном. Благодаря вазелину создается герметичность препарата, что препятствует его подсыханию. Последнее чрезвычайно важно, так как влагалищные трихомонады быстро прекращают движения при высыхании препарата.Ввиду того, что при длительном пребывании препаратов при комнатной температуре трихомонады теряют подвижность, исследование следует проводить возможно быстрее после получения материала (в течение не более 1 часа).
Исследование нативных препаратов проводят под микроскопом с естественным или искусственным освещением немедленно после его приготовления при общем увеличении 280-400 раз (объектив 40, окуляр 7 или 10). Влагалищная трихомонада определяется по грушевидной, округлой или овальной форме тела по размерам близким к лейкоцитам. Она имеет характерные толчкообразные движения ундулирующей мембраны и жгутиков, которые особенно хорошо видны при исследовании в микроскопе с темнопольным или фазовоконтрастным конденсором. Трихомонады совершают активные движения поступательного и вращательного характера.
При исследовании нативных препаратов влагалищные трихомонады иногда трудно отличимы от жгутиковых семейства бодонидов, которые могут быть занесены в препарат из воды, загрязненной посуды и т.д. В отличие от трихомонад, бодониды имеют лишь 2 жгутика и очень быстро двигаются по прямой. К ошибкам может привести и наличие в препарате подвижных бактерий, которые, прикрепляясь к лейкоцитам, создают впечатление большого количества подвижных трихомонад.
Метод нативных препаратов высоко специфичен. Однако обнаружить в них влагалищные трихомонады можно лишь при наличии жизнеспособного возбудителя с активной подвижностью, что достигается технически правильным взятием материала и своевременным его просмотром. Чувствительность метода особенно снижена при бессимптомном течении заболевания. Измененные формы трихомонад, неподвижные особи также редко выявляются данным методом.
3.3.2. Микроскопия окрашенных препаратов
Для выявления влагалищных трихомонад мазки с материалом после фиксации возможно окрашивать различными способами, как простыми - окрашивание одним красителем, так и сложными - окрашивание несколькими красителями. После окрашивания мазки микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа и общим увеличением 500-1000 раз. Материал берут из очагов поражения при помощи стерильного зонда и наносят на чистое обезжиренное предметное стекло равномерным тонким слоем. После высушивания на воздухе, препараты фиксируют в течении 3-5 минут в метиловом спирте, или этиловом 96% спирте, или в смеси Никифорова. Наиболее часто используют следующие способы окраски:
1. Окрашивание по Романовскому-Гимзе. Фиксированный препарат помещают в рабочий раствор краски (исходный раствор краски разведенный дистиллированной водой в соотношении 1:10) на 25-60 минут, затем его промывают водой, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы. Ядра трихомонад окрашиваются в фиолетовый или фиолетово-рубиновый цвет, протоплазма - в голубой, блефаропласт, жгутики, аксостиль и хроматиновые зерна протоплазмы окрашиваются в розовый или красный цвет;
2. Окрашивание 1% водным раствором метиленового синего (1 г метиленового синего растворяют в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют через бумажный фильтр). На препарат наносят 1% раствор метиленового синего на 1 минуту, затем тщательно смывают оставшийся краситель под струей холодной воды, высушивают и микроскопируют. Препарат синего цвета. Бактериальная флора прокрашивается в синий цвет разной интенсивности. Влагалищные трихомонады различной формы (округлой, овальной, полигональной) расположены в слизи, между клеточными элементами - четко просматривается оболочка, ядро расположено эксцентрично, интенсивно окрашено в синий цвет, протоплазма нежная, сетчатая, светло-синяя, вакуоли бесцветны
.3. Окрашивание 0.5% раствором бриллиантового зеленого (0.5 г бриллиантового зеленого растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воды, фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр). На препарат наносят 0.5% водный раствор бриллиантового зеленого на 1 минуту, затем тщательно смывают краситель под струей холодной водопроводной воды, высушивают и микроскопируют. Препарат зеленого цвета - ядра клеток окрашены в зеленый цвет, протоплазма в светло-синий. Слизь зеленого цвета. Бактериальная флора окрашивается в зеленый цвет разной интенсивности. Влагалищные трихомонады различают разной формы (округлой, овальной, полигональной), они расположены между клеточными элементами в слизи, четко просматривается оболочка, ядро интенсивно окрашено в зеленый цвет, расположено эксцентрично, протоплазма сетчатая, светло-зеленого цвета, вакуоли бесцветны.
4. Окрашивание по модифицированному способу Грама. Метод основан на свойстве влагалищных трихомонад и других грамотрицательных микроорганизмов при обесцвечивании их определенное время в этиловом спирте, отдавать основной фиолетовый краситель и докрашиваться, в дальнейшем, дополнительным оранжево-красным.
Реактивы:
- 1% водный раствор кристаллвиолета (1 г кристаллвиолета растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воды, раствор фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр);
- водный люголевский раствор (2 г йодистого калия растворяют в 300 мл дистиллированной воды, в полученном растворе растворяют 1 г чистого йода, фильтруют через бумажный фильтр;
- 96% этиловый спирт;
- 1% водный раствор нейтрального красного (1 г нейтрального красного растворяют в 100 мл дистиллированной воды и фильтруют через бумажный фильтр.
Препарат покрывают полоской фильтровальной бумаги и заливают ее 1% раствором кристаллвиолета на 1 минуту. Следят, чтобы между фильтровальной бумагой и стеклом не было пузырьков воздуха, их удаляют, придавливая полоску смоченной кристаллвиолетом фильтровальной бумаги стеклянной пипеткой или палочкой. Через 1 минуту бумагу снимают, препарат промывают водопроводной водой и заливают раствором Люголя, который выдерживают в течении нескольких секунд до почернения мазка. Затем остаток люголевского раствора смывают и приступают к обесцвечиванию препарата в 96% этиловом спирте. Обесцвечивание проводят под контролем глаза, поочередно погружая и вынимая препарат из спирта, находящегося в стаканчике. Обесцвечивают препарат до тех пор, пока с его тонких участков перестанут стекать фиолетовые струйки красителя и они станут бледно-серого цвета. Препарат быстро промывают под струей водопроводной воды, а затем докрашивают в течение 3 минут 1% водным раствором нейтрального красного. Препарат тщательно промывают, пока струя воды, стекающая с него, станет прозрачной, высушивают и микроскопируют. При правильной окраске препарат оранжево-красного цвета на тонких участках, лилово-фиолетового на толстых. Ядра клеточных элементов (лейкоцитов, эпителиальных клеток) должны частично удерживать основную фиолетовую окраску, т.е. в центре они должны быть окрашены в фиолетовый цвет, по периферии в оранжево-красный. Высокое качество окраски обеспечивается своевременным прекращением обесцвечивания препарата.
Влагалищные трихомонады окрашиваются бледно - оболочка в виде тонкой полоски окружает сетчатую протоплазму оранжево-красного цвета, ядро сиреневого или фиолетового цвета, жгутики и ундулирующая мембрана не просматривается. Положительный ответ нужно давать при обнаружении только типичных форм влагалищных трихомонад. При обнаружении измененных (округлые, нетипично-окрашенные и др.), но похожих на влагалищных трихомонад простейших, надо исследовать повторно взятый материал или сделать посев на питательные среды.
Микроскопия окрашенных препаратов является простым, дешевым и доступным методом, не требующим немедленного проведения исследования и специального оборудования. Однако он имеет крайне низкую чувствительность и специфичность.
3.3.3. Культуральный метод
Культуральный метод наиболее чувствительный и специфичный. Влагалищные трихомонады дают хороший рост на искусственных питательных средах при условии соблюдения правил забора материала для исследования и его культивирования. Питательные среды должны содержать антибиотики для подавления роста сопутствующей микрофлоры. Влагалищные трихомонады - факультативные анаэробы. Оптимум их роста в слабокислой среде при среднем рН 5.8 - 6.3 и температуре 37
° С, поэтому перед посевом культуральную среду следует прогреть, если она хранилась в холодильнике. Следует избегать перегрева культуры выше 37-38° С, т.к. повышение температуры влагалищные трихомонады переносят хуже, чем понижение. Материал для исследования из очагов поражения следует брать стерильным зондом или бактериальной петлей. Материалом для исследования могут служить центрифугаты смывов стерильным физиологическим раствором, которые вносят в культуральную среду стерильной пастеровской пипеткой. Стерильной пастеровской пипеткой следует пользоваться при пересеве выделенных штаммов.При выращивании на жидких питательных средах влагалищные трихомонады дают придонный рост в виде плотного беловатого осадка, из которого пастеровской пипеткой берут материал для исследования в нативном препарате. Микроскопическое исследование культур и идентификацию следует производить на 3-5-й день, при отрицательных результатах на 7-9-й и на 11-17-й день после посева, т.к. длительность
цикла развития влагалищных трихомонад в культуре зависит от величины посевной зоны. Из придонного роста готовят нативный препарат одним из описанных выше способов и микроскопируют с объективом 40 или 90, окуляр 7 или 10. Влагалищные трихомонады в поле зрения могут быть одиночными или большими скоплениями, активно движущиеся, при этом хорошо просматривается движение жгутиков и ундулирующей мембраны. Возможно определять влагалищные трихомонады в культуре методом РНИФ (реакция непрямой иммунофлюоресценции).Культуральный метод продолжительный по времени, требует сравнительно дорогостоящих сред.
К недавно внедренным в практическую лабораторную диагностику перспективным методам относится реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), позволяющая определять антиген влагалищной трихомонады в мазках-отпечатках и другом биологическом материале.
3.3.4. Иммунологический метод
Иммунологический метод позволяет определить специфический поверхностный антиген влагалищной трихомонады реакцией непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) посредством набора “ТрихоСлайд” (АО ЛАБдиагностика, Россия). Материалом для исследования служат мазки-отпечатки из различных очагов поражения, которые берут и наносят на чистое обезжиренное предметное деколированное (со специальной лункой) стекло стерильными одноразовыми зондами, имеющими ватный тампон с повышенными сорбционными свойствами. При нанесении материала тампоном многократно касаются поверхности предметного стекла. После высыхания на воздухе препарат фиксируют 5 минут 96% этиловым спиртом или ацетоном (наносят на препарат несколько капель безводного ацетона до полного его испарения). Фиксированные препараты лучше не хранить, так как при хранении влагалищные трихомонады разрушаются, что может затруднить постановку правильного диагноза. После фиксации проводят “окрашивание” препарата (реакция антиген - антитело), которое имеет два этапа. На первом этапе на препарат наносят 30 мкл реагента №1- специфические противотрихомонадные АТ - и инкубируют его во влажной камере (избегать подсыхания реактива) при комнатной температуре или 37
° С 15 минут. Затем препарат промывают дистиллированной водой 30 секунд, высушивают на воздухе и наносят 30 мкл реактива №2 - антитела к противотрихомонадным АТ, меченые ФИТЦ - инкубируют 15 минут во влажной камере при комнатной температуре или 37° С. После этого препарат промывают 30 секунд дистиллированной водой, высушивают на воздухе и микроскопируют в люминисцентном микроскопе с использованием масляной или водной иммерсионной системы. Препараты к микроскопии готовят также, как и при диагностике хламидиоза методом РИФ.Трихомонады выявляются в виде полиморфных мембраноограниченных структур, имеющих ярко-зеленое свечение. У подвижных форм могут прокрашиваться жгутики. Неспецифическая бактериальная флора окрашивается в оранжевый цвет, клетки эпителия, лейкоциты, сперматозоиды окрашиваются в оранжевый и красно-бурый цвета. Допускается неспецифическое диффузное слабо-зеленое свечение цитоплазмы эпителиальных клеток, слизи и посторонней микрофлоры. результат считают отрицательным,
если в мазке отсутствует специфическое свечение при обязательном наличии не менее 10 клеточных элементов.Метод РНИФ обладает высокой чувствительностью и специфичностью, сравнимой с культуральным методом, позволяет выявлять нежизнеспособные формы возбудителя, не определяемые культуральным методом. В отличие от нативных препаратов, он позволяет выявить атипичные и неподвижные формы влагалищных трихомонад. Это повышает его диагностическую значимость. Метод РНИФ сравнительно дешев, прост в выполнении, не требует специального оборудования, позволяет визуально контролировать качество взятия материала и получить ответ в течение 40-60 минут. Все это делает его методом выбора для диагностики урогенитального трихомониаза.
